Электронная микроскопия сперматозоидов

Электронная микроскопия (ЭМ) — это метод исследования структур тканей и клеток, которые плохо видны в обычном световом микроскопе, дающем оптическое увеличение только до 1500 раз. Работа электронного микроскопа основана на применении направленного потока электронов, фокусируемого электромагнитами. Различные структуры клеток после специального окрашивания по-разному задерживают электроны, в результате на экране формируется черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз.

При ЭМ ткани яичка, полученной при биопсии, можно оценить структуру синцития сперматогенного эпителия, наличие специальных контактов между клетками Сертоли (сустентоциты), образующих гемето-тестикулярный барьер (ГТБ), состояние собственной оболочки семенного канальца, клеток Лейдига (эндокриноциты), продуцирующих тестостерон, и много другой информации.

Норма. Видна оболочка семенного канальца, все слои которой располагаются параллельно друг другу и имеют характерные признаки организации. На базальной мембране расположена сперматогония в прелептотене. В ее цитоплазме обилие рибосом и полисом.

Увелич. х21000.

(оригинальные фото Н.К.Чичинадзе, В.А.Божедомова, 2001)

Бесплодие. Слои собственной оболочки канальца утолщены, нарушена их целостность. Цитоплазма сустентоцита бедна органеллами. В интерстиции демонстрируются эндокриноциты фетального типа, имеющие веретенообразную форму. Значительно уменьшен объем цитоплазмы. Уменьшено число и размеры митохондрий, плотность их матрикса повышена.

Увеличение х10000.

(оригинальные фото Н.К.Чичинадзе, В.А.Божедомова, 2001)

• При ЭМ сперматозоидов, выделенных непосредственно из эякулята (спермы), можно оценивать строение мембран митохондрий, являющихся «энергетическими станциями» клеток, структуру микротрубочек жгутика, обеспечивающего движение сперматозоида, наличие и целостность акросомы, необходимой для проникновения в яйцеклетку, некоторые другие характеристики.

По M.Luconi et al. // Male infertility: Diagnosis and Treatment. S.C.Oehninger, T.F.Kruger. (Eds). Informa UK, 2007: 14.

ЭМИС при тотальной астенозооспермии (некрозооспермии)

• Для клинических целей доказана целесообразность использования ЭМИС при диагностике генетически обусловленных (т.е. имеющих место у всех сперматозоидов) дефектов строения микротрубочек жгутика, приводящих к полной неподвижности сперматозоидов (синдром Картагенера) и/или функциональной непроходимости придатка (синдром Юнга).

В обоих случаях полная неспособность сперматозоида к движению и нарушения функции мерцательных ресничек эпителиальных клеток придатка связаны с отсутствием центральной пары микротрубочек, радиальных спиц, или динеиновых ручек. Такие нарушения весьма редки – реже, чем 1 случай на 1000 обследованных мужчин из бесплодных пар; в нашей клинике мы наблюдали только трех таких пациентов. Лечение основано на проведении ЭКО ИКСИ и достаточно эффективно.

ЭМИС и нарушения акросомы

ЭМИС позволяет выявлять глобулозооспермию – структурное нарушение сперматозоидов, при котором аппарат Гольджи не трансформируется в акросому, необходимую для оплодотворения яйцеклетки; в сперматозоидах при этом отсутствует акросомный колпачек, вследствие чего их головка имеет округлую форму. Однако при данном синдроме ЭМИС не является необходимым методом – стандартная микроскопия окрашенного препарата позволяет надежно диагностировать подобные нарушения.

ЭМИС позволяет выявлять сперматозоиды с интактной и прореагировавшей акросомой как в сперме, так и после взаимодействия с zona pellucida. Это позволяет диагностировать формы мужского бесплодия, связанные с нарушениями акросомной реакции.

Акросомная реакция сперматозоидов и ЭМИС

Сперматозоиды человека снаружи и внутри zona pellucida через 8 часов после оплодотворения in vitro: сперматозоиды 1 и 3 с не прореагировавшей (интактной) акросомой на головке (А) и в экваториальном сегменте (Е), сперматозоид 2 демонстрирует частично прореагировавшую акросому в виде образования визикул (V), но так же не проникший в зону; сперматозоиды 4 и 5 проникли внутрь zona pellucida.

По Overstreet and Hembree //

Andrology: Male Reproductive Health and Disfunction.

3rd. E.Nieschlag., H.M.Behre, S.Nieschlag (Ed.), 2010: 74.

Но и в этом случае ЭМИС не имеет никаких преимуществ по сравнению с другими методами диагностики нарушений акросомной реакции: проточной цитометрией, флюоресцентной микроскопией, энзиматическим методом. А количественный подсчет необходимого количества сперматозоидов (не менее 100), у которых срез прошел строго через головку, при ЭМ практически невыполнимая задача. Поэтому ЭМИС не рекомендована для оценки акросомной реакции в клинических целях ни одним из современных руководств, посвященных мужскому бесплодию (см. ниже).

ЭМИС и хроматин сперматозоидов

ЭМ применяют для оценки апоптоза - запрограммированной гибели клеток. В клетках, где происходит апоптоз, наблюдается увеличение электронной плотности хроматина, возникают внутриядерные вакуоли. Но это касается только соматических клеток – клеток, из которых состоит все тело, но только не сперматозоидов. Уникальность сперматозоидов, в этом смысле, состоит в том, что в них повышение плотности хроматина – нормальный процесс, связанный с заменой обычных хромосомных белков гистонов на уникальные белки, присущие только сперматозоидам – протамины. Такой процесс, называемый протаминация, позволяет «упаковать» спермальную ДНК в несколько десятков раз более плотно, чем в любой другой клетке даже в момент деления, и защитить ее от возможного повреждения внешними факторами, например активными формами кислорода. Поэтому в сперматозоидах высокая плотность хроматина является не признаком повреждения клетки, а наоборот, нормальным состоянием.

Невозможность оценивать апоптотические изменения в сперматозоидах, используя обычные ультраструктурные изменения, авторы специального коллективного Руководства «Хроматин сперматозоидов» (ред. A.Zini и A.Agarwal) иллюстрируют представленным рисунком.

Непригодность ЭМИС для оценки апоптоза, других повреждений хроматина и ДНК сперматозоидов:

1. Высокая плотность (черная окраска) в средней части сперматозоидов, где локализованы митохондрии, при ЭМИС характерны для всех сперматозоидов (увеличение х4000).

2. Невозможность охарактеризовать апоптоз по миграции митохондрий в ядерную область и их несимметричному расположению, поскольку у сперматозоидов эти органеллы находятся в различных компартментах – изолированных друг от друга мембранами отсеков клетки.

3. Высокая электронная плотность свидетельствует не о повреждениях, а, наоборот, о нормальном компактном состоянии хроматина сперматозоидов (увеличение х12000).

По Aitken R.J., De Lulis G.N. //

Sperm chromatin: biological and clinical application in male infertility and assisted reproduction /

A.Zini, A.Agarwal (Ed.), 2011, Springer: 288.

При этом нужно подчеркнуть, что маленькая микрофотография на данном рисунке является единственным электронно-микроскопическим изображением сперматозоида во всей более чем 500-страничной книге, посвященной именно хроматину сперматозоидов.

Никаких сведений о применении ЭМИС для оценки качества наследственного материала сперматозоидов - ни протаминации, ни фрагментации ДНК, - нет ни в одном другом современном Руководстве по мужскому бесплодию. Для этого рекомендуют иные методы, доказавшие свою клиническую значимость: дисперсии хроматина в агарозном геле,  TUNEL, окраску хромомицином А3, анилиновым синим, некоторые другие.

ЭМИС и вирусная инфекция

Метод ЭМ позволяет обнаруживать в клетках вирусы. Уточнение ультраструктуры различных вирусов стало одним из главных достижений применения данного метода в биологии и медицине. Многие вирусы – простого герпеса типов 1 и 2, ЦМВ, папилломы человека разных типов и другие, - могут прилипать (адгезироваться) к наружной мембране сперматозоида и способствовать передаче данной инфекции партнеру. Индуцируя апоптоз, они могут влиять на качество спермы. Однако проникать внутрь зрелых сперматозоидов вирусы не могут, поскольку для этого они должны индуцировать эндоцитоз – погружение части мембраны клетки вместе с вирусом внутрь клетки, - а сперматозоиды к этому процессу не способны. Причина такой особенности – отсутствие свободного объема в клетке, утрата большей части цитоплазмы в процессе спермиогенеза.

По Depuydt CE et al. //Facts Views Vis Obgyn.2016 Dec; 8(4): 211-222.

Проникновение вирусов в сперматозоиды потенциально возможно только на этапе митоза сперматогоний. Но в этом случае вирусная инфекция должна была бы поразить яички, что неизбежно вызвало бы орхит.

Возможность вирусного инфицирования яйцеклетки при оплодотворении крайне мала. Сперматозриды с прикрепившимися к ним вирусами будут фагоцитированы иммунокомпетентными клетками репродуктивного тракта женщины. Вирусное заражение плода, наблюдаемое иногда в акушерской практике, возможно позже - при прохождении по родовым путям в процессе естественных родов.

Для диагностики наличия вирусной инфекции в сперме ЭМИС не требуется. Достаточно использования метода амплификации генов. Чтобы уточнить, расположены вирусы в семенной плазме, или непосредственно на сперматозоидах, что особенно важно для ВИЧ-инфекции, следует применять определение ДНК и РНК возбудителя отдельно в нативной сперме и фракции отмытых сперматозоидов.

В целом, ЭМИС – весьма трудоемкий, дорогой и субъективный метод исследования, с огромным трудом поддающийся количественной морфометрии. Срезы могут проходить через любой участок сперматозоида, толщина среза составляет доли процента от длины самого сперматозоида, что не позволяет анализировать необходимое количество клеток в случае неких количественных (не генетически обусловленных) нарушений. Поэтому показания для выполнения ЭМИС весьма ограничены.

• Электронная микроскопия сперматозоидов (ЭМИС) не входит в перечень методов, рекомендуемых «Руководством ВОЗ по исследованию и обработке спермы человека» (2010), руководство по бесплодию Европейской урологической ассоциации (EAU-2017), Европейской ассоциацией репродукции и эмбриологии (ESHRE-2017), Американской урологической ассоциацией (2011), другие международные рекомендации. ЭМИС не дает никакой новой информации, которая не могла быть получена другими методами и влияла бы на выбор лечения. Поэтому проведение ЭМИС бессмысленно и с клинических, и с экономических позиций.

Основная литература, которая была проанализирована по данной теме:

• WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen / Editor-in-chief Dr. Trevor G. Cooper - 5th ed. 2010, 292 р.

• Sperm chromatin: biological and clinical application in male infertility and assisted reproduction / A.Zini, A.Agarwal (Ed.), 2011, Springer, 512.

• Andrology: Male Reproductive Health and Disfunction. 3rd. E.Nieschlag., H.M.Behre, S.Nieschlag (Ed.), 2010, 629 р.

• Male infertility. S.J.Perekatti, A.Agarwal (Eds.). Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2012, 518 р.

• EAU Guidelines on Male Infertility. A. Jungwirth (Chair), et al. © European Association of Urology, 2017, 42 р.

• Clinical management of male infertility / G.Gavallini, G.Beretta (eds.). Springer International publishing Switzerland, 2015, 187 р.

• American Urological Association Education and Research, Inc. (2010) The optimal evaluation of the infertile male: AUA best practice statement. Linthicum (MD): American Urological Association Education and Research, /Male-Infertility. Accessed 31 July 2014

• Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine (2015) Diagnostic evaluation of the infertile male: a committee opinion. Fertil Steril 103: e18–e25 Accessed 28 May 2015