Фрагментация ДНК сперматозоидов

ОЦЕНКА ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ

Повреждение спермальной ДНК означает потерю целостности структуры всей молекулы ДНК сперматозоида.

• Термином «повреждение ДНК сперматозоидов» обозначают многие дефекты структуры хроматина, в том числе разрывы одной, или двух спиралей молекулы ДНК, делеции, или видоизменения, образование дополнительных связей в спирали, или между спиралями ДНК, и неправильное размещение протаминов из-за дефектного крослинкинга ДНК и белков.

Повреждение хроматина может произойти на любом этапе сперматогенеза, спермиогенеза, при прохождении через эпидидимис, а in vitro - во время подготовки сперматозоидов к искусственному оплодотворению.

• Дефектные сперматозоиды, содержащие поврежденную ДНК, сохраняют способность к оплодотворению. Однако с такими повреждениями ДНК связаны некоторые формы бесплодия, например, идиопатическое бесплодие, повторяющиеся неудачи внутриматочной инсеминации (ВМИ) и ЭКО, привычные выкидыши. Более того, с повреждениями ДНК спермы связан повышенный риск раковых заболеваний и передающихся дефектов у потомства.

Из множества предполагаемых на сегодняшний день причин, вызывающих нарушение функции сперматозоидов, повреждение ядерной ДНК – наиболее изученная и все более признаваемая в качестве ключевого фактора, влияющего на качество эмбриона, его развитие и имплантацию. Вы можете ежедневно сдать анализ на фрагментацию ДНК в Лаборатории Клинической Андрологии.

Стоимость анализа на фрагментацию ДНК:

• Повреждения спермальной ДНК связаны с параметрами спермограммы: снижением концентрации, подвижности и доли нормальных форм сперматозоидов. В то же время в 10-20% случаев могут иметь место при «нормозооспермии».

Ведущая причина повреждения ДНК – оксидативный стресс сперматозоидов, вызванный избыточной продукцией активных форм кислорода (см. рисунок по Aitken RJ et al., 2014).

Другая причина – незавершенный апоптоз сперматозоидов, связанный с нарушениями спермато- и спермиогенеза, и/или элиминацией дефектных форм в эпидидимисе.

По Aitken RJ et al. // Asian J Androl. 2014, 16 (1): 31.

• Повреждение ДНК спермы - это многофакторный процесс, зависящий как от генетической предрасположенности, так и от внешних повреждающих факторов (курение, перегревание, токсические вещества и др.).

Поскольку это может иметь несколько причин, оценка фрагментации, оксидативного стресса и нарушений конденсации (упаковки) хроматина особенно рекомендуются для:

• пар с историей выкидышей;

• пар с необъяснимым бесплодием более 6 месяцев;

• мужчин старше 40 лет;

• пациентов с варикоцеле;

• пациентов с системными заболеваниями (диабет, ожирение и др.);

• мужчин с вредными факторами образа жизни (курение, ионизирующее излучение, токсические вещества, перегревание, в т.ч. при использовании облегающей одежды, несбалансированное питание и др.);

• мужчин с историей рака и химиотерапией;

• мужчин, проходящих лечение некоторыми рецептурными препаратами;

• у мужчин, перенесших урогенитальные инфекции;

• плохом качестве эмбриона во время повторных циклов донорства яйцеклеток;

• мужском идиопатическом бесплодии.

• Для обнаружений повреждений ДНК в сперматозоидах используют различные методы: дисперсии хроматина в агарозном геле (SCD), электрофореза ДНК после денатурации (COMET), терминальной метки (TUNEL) и др.

В таблице мы суммировали принципы и интерпретации наиболее широко используемых тестов.

Для оценки фрагментации ДНК исторически первым более 35 лет назад начали применять метод SCSA. Для научных целей наиболее часто применяют метод TUNEL, способный выявлять как одноцепочечные разрывы, так и двуцепочечные разрывы ДНК. Самый современный и удобный для клинического применения – метод SCD; некоторые считают его также самым чувствительным.

Конденсацию (упаковку) хроматина сперматозоидов оценивают по соотношению белков гистонов и протаминов в сперматозоидах, для чего применяют окраску анилиновым синим и хромомицином 

Оригинальные фото из нашей лаборатории:

А- TUNEL; Б- SCD; В-гистоны/протамины

Обнаружение повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов требует лечения, направленного на устранение предполагаемого патогенетического фактора: инфекционно-воспалительных процессов, и даже бессимптомного носительства таких инфекций, как Chlamydia trachomatis, Mycoplasma sp., Ureaplasmаurealyticum, некоторых серотипов E.coli и др., перегревания яичек (в т.ч. связанного в варикоцеле), курения, действия некоторых лекарственных средств (paroxetine,miloxan, pentoxyphylline и др.), избыточного веса, нарушения углеводного обмена и др. В случае обнаружения оксидативного стресса – дополнительно применение различных нутриентов-антиоксидантов. В самых сложных случаях может быть полезным получение сперматозоидов непосредственно из яичек, где они защищены от действия активных радикалов гемато-тестикулярным барьером. Но в этом случае последующие неудачи ЭКО ИКСИ могут быть связаны с нарушением упаковки хроматина, поскольку необходимая для полноценного созревания сперматозоидов замена гистонов на протамины происходит уже в придатках яичек.

Последние годы для нормализации структуры хроматина сперматозоидов достаточно эффективно используются современные клеточные технологии, в т.ч. связанные с применением МСК и клеток Сертоли.

Доктор мед. наук, профессор В.А. Божедомов

Несколько цитат о значении фрагментации ДНК сперматозоидов:

• «…В сперматозоидах у мужчин с олигозооспермией увеличивается повреждение ДНК. Это увеличение связано с уменьшением шансов естественной беременности и увеличением вероятности ранней потери беременности…»

Male Infertility / A. Jungwirth (Chair) et al. ©

European Association of Urology, 2017: 14.

• «…Существует два типа фрагментации ДНК сперматозоидов, из которых один зависит от параметров спермограммы, а второй – нет...»

Muratori M. et al.// Hum. Reprod., 2008, V23 (5), p.1035-1043.

• «…Дефектные сперматозоиды, содержащие поврежденную ДНК, сохраняют способность к оплодотворению. Однако с такими повреждениями ДНК связаны некоторые фенотипы бесплодия, например, необъяснимое и идиопатическое бесплодие, повторяющиеся неудачные ВМИ и ЭКО, и привычные выкидыши. Более того, с повреждениями ДНК спермы связан повышенный риск раковых заболеваний и передающихся дефектов у потомства…»

Sperm chromatin: biological and clinical application in male infertility and assisted reproduction / A.Zini, A.Agarwal (Ed.), 2011, Springer, 512.

• «…Из множества предполагаемых на сегодняшний день причин, вызывающих нарушение функции сперматозоидов, повреждение ядерной ДНК – наиболее изученная и все более признаваемая в качестве ключевого фактора, влияющего на качество эмбриона, его развитие и имплантацию…»

Mallidis C. et al.// Hum Reprod., 2010, V.26, N7, P.1641-1649

• «…Сперматозоиды с фрагментированной ДНК могут оплодотворять зрелые ооциты, но активация генома отцов может нарушать эмбриональное развитие, приводя к предимплантационным и постимплантационным потерям. Этот тип повреждения может возникнуть у эмбрионов с нормальным комплементом хромосом и, возможно, объяснить, почему некоторые эмбрионы с нормальными кариотипами не способны обеспечить беременность у пациентов с необъяснимыми выкидышами. В целом, чем больше степень повреждения ДНК передается эмбриону отцовским геномом, тем раньше этот ущерб будет проявляться во время развития эмбриона…»

Bareh Gihan M. еt al.// Fertility and Sterility, 2016, 105 (2): 15-282

• «…Недавние исследования показали важность целостности ДНК спермы как важного фактора, который влияет на функциональную компетентность спермы. Поэтому обнаружение фрагментации ДНК сперматозоидов может быть клинически полезным, как часть процесса оценки фертильности … Тесты фрагментации ДНК спермы практически не имеют разницы в прогнозируемом значении между IVF и ICSI…»

Cissen M et al. Measuring Sperm DNA Fragmentation and Clinical Outcomes of Medically Assisted Reproduction: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS One. 2016 Nov 10; 11(11):e0165125.

• «…Современные модели на животных и экстраполяционные данные в исследованиях на людях вызывают озабоченность проблемами со здоровьем у потомства, полученного из спермы, с повышенным уровнем фрагментации ДНК...»

Bach PV, Schlegel PN. Sperm DNA damage and its role in IVF and ICSI. Basic Clin Androl. 2016, 5 (26): 15.

• «…Уникальный процесс уплотнения хроматина в сперматозоиде имеет важные последствия как для развития скрининговых тестов мужского бесплодия, так и для понимания характеристик хроматина спермы, которые могут повлиять на результаты вспомогательных репродуктивных технологий...»

Palermo GD et al. Perspectives on the assessment of human sperm chromatin integrity. Fertil Steril. 2014 Dec; 102(6):1508-17.

• “…Мета-анализ с двумерным случайным эффектом дал значение AUC (площадь под кривой) 0,92 с чувствительностью (доверительный интервал 95%) 0,80 (0,78-0,82) и специфичностью 0,83 (0,80-0,86) для использования теста SDF в дифференциации бесплодных мужчин от нормального фертильного контроля. Более того, анализ подгрупп показал, что анализ SDF с одним тестом TUNEL привел к величине AUC 0.9506 с объединенной чувствительностью 0.77 (0.74-0.8) и специфичностью 0.91 (0.87 - 0.94), в то время как тесты SCD и Comet отображали комбинированную чувствительность 0,77 (0,67-0,81) или 0,91 (0,88-0,94) и специфичность 0,84 (0,75-0,91) или 0,63 (0,54-0,70), сопровождаемая величиной AUC 0,84 или 0,94…»

Cui ZL et al. Diagnostic Accuracies of the TUNEL, SCD, and Comet Based Sperm DNA Fragmentation Assays for Male Infertility: a Meta-analysis Study. Clin Lab. 2015; 61(5-6): 525-35.