Оксидативный стресс сперматозоидов (АФК\ROS тест)

ПРИЧИНЫ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА СПЕРМАТОЗОИДОВ (АФК\ROS тест)

Активные формы кислорода (АФК), или reactive oxygen species (ROS), являются метаболитами кислорода и включают супероксид-анион, перекись водорода, гидроксильные и гидропероксильные радикалы и оксид азота.

Когда АФК присутствуют в сперме в избытке, они могут инициировать патологические изменения сперматозоидов, вызывая окислительное повреждение клеточных липидов, белков и ДНК. Такие нарушения получили названия оксидативный стресс (ОС) сперматозоидов.

За счет снижения подвижности, нарушения акросомной реакции, повреждения рецепторов сперматозоидов ОС приводит к снижению вероятности наступления беременности. Вызывая разрывы (фрагментацию) ДНК сперматозоидов ОС приводит к нарушению развития зародыша, что сопровождается замершими беременностями, выкидышами на ранних сроках, аномалиями развития и возникновением злокачественных новообразований у детей.

Человеческий сперматозоид очень восприимчив к оксидативному стрессу.

ОС сперматозоидов оказывает отрицательное влияние, как на прогноз естественного зачатия, так и на результаты вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в т.ч. ИКСИ.

Согласно Рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (WHO-2010), Европейской ассоциации репродукции человека и эмбриологии (ESHRE-2016) и Европейской урологической ассоциации (EAU-2017) определение АФК входит в перечень рекомендуемых методов обследования при мужском бесплодии и нарушениях развития беременности.

F​ Оксидативный стресс сперматозоидов имеет место в 30-80% (по нашим данным около 40%) случаев при бездетном браке.

Факторы риска ОС сперматозоидов многочисленны:

•​ инфекционно-воспалительные процессы в органах мочеполового тракта;

•​ варикоцеле;

•​ крипторхизм;

•​ перегревание при лихорадочных состояниях, или действии внешних источников тепла (сауна, горячая ванна и др.);

•​ психо-эмоциональные стрессы;

•​ аутоиммунные реакции против сперматозоидов, сопровождающиеся выработкой антиспермальных антител (АСАТ);

•​ системные заболевания (диабет, подагра и др.);

•​ курение;

•​ возраст старше 40 лет;

•​ нехватка антиоксидантов в пище;

•​ генетические дефекты системы антиоксидантной защиты.

Для оценки ОС сперматозоидов в научных исследованиях могут применяться различные тесты: прямые методы определения АФК (хемилюминесценция, NBT-тест), или непрямые методы оценки повреждений, возникших в результате ОС (определение изопростана, малонового альдегида и др.).

Единственный метод оценки оксидативного стресса, рекомендованный ВОЗ-2010 для клинических целей – метод люминолзависимой хемилюминесценции, который используем мы.

В этой процедуре применяется чувствительный люминометр для измерения малых количеств света, генерируемого сперматозоидами человека, в присутствии хемилюминесцентного зонда, такого как люминол. Описанная в Руководстве ВОЗ-2010 и используемая нами методика основана на применении смеси люминола и пероксидазы хрена для проведения чувствительных измерений образования перекиси водорода.

Примеры записи люминолзависимой хемилюминесценции эякулятов различных пациентов

(кривые I-IV).

В эякуляте человека АФК продуцируются сперматозоидами, незрелыми клетками сперматогенеза и лейкоцитами. Один лейкоцит может генерировать по меньшей мере в 100 раз больше АФК, чем сперматозоид.

Различные модификации метода применяются для оценки функциональной активности лейкоцитов и непосредственно ОС сперматозоидов.

В нашей лаборатории в настоящее время применяют три метода оценки ОС на основе хемилюминесценции:

-​ определение АФК в нативном эякуляте, что отражает суммарную продукцию АФК, зависящую в значительной степени от концентрации лейкоцитов и активности воспалительного процесса;

-​ оценка продукции АФК отмытыми сперматозоидами (на 10 млн. клеток), что отражает выраженность внутриклеточного ОС;

-​ определение антиокислительной емкости семенной плазмы, что служит основанием для назначения антиоксидантов.

Семенная плазма обладает свойствами связывать избыточную продукцию АФК, но активность антиоксидантных ферментов может быть у некоторых мужчин недостаточной. Для характеристики антиоксидантной емкости спермы используется специальная методика с использованием сульфата железа.

Запись хемилюминесценции модельной системы, генерирующей АФК (кривая М), и модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением 0,1мл спермоплазмы пациентов I, II, III, IV (кривые I-IV).

Доктор мед. наук, профессор В.А.Божедомов

Несколько цитат о роли активных форм кислорода (АФК/ROS):

-​  «…Высокое производство ROS может вызывать перекисное повреждение и потерю функции спермы, а также повреждение ДНК, как в ядерном, так и в митохондриальном геномах…»

по WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen / Editor-in-chief Dr. Trevor G. Cooper - 5th ed. 2010: 132.

-​ «… Оксидативный стресс является одной из ведущих причин повреждения спермальных ДНК…»

По C.Celik-Ozenci, G.Huszar // Male infertility. S.J.Perekatti, A.Agarwal (Eds.). Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2012: 462.

-​  «…Считается, что от 30% до 80% случаев мужского бесплодия связаны с повреждающим действием окислительного стресса на сперму, и 1 человек из 20 будет страдать из-за этого от субфертильности…»

Showell M.G. et al. Antioxidants for male subfertility (Review). Copyright © 2014 The Cochrane Collaboration. Published by JohnWiley & Sons, Ltd.

-​ «…Повышение уровня ROS, связанное с лейкоцитоспермией, может вести к повреждению клеточных мембран, внеклеточных протеинов, органелл и спермальных ДНК…»

По Smelov V.// Prostatitis and its management. T.Cai, T.E.B.Johansen (Eds.).-Springer Cham Heidelberg New York Dordrecht London, 2016: 123.